No organismo, o óxido nítrico e sintetizado a partir da arginina e do oxigénio, pela enzima sintase do óxido nítrico (NOS).

O endotélio (a fina camada de células mais interna dos vasos sanguíneos) usa o óxido nítrico para comandar o relaxamento do músculo liso da parede do vaso, fazendo com que este dilate aumentando assim o fluxo sanguíneo e diminuindo a pressão arterial. Isto explica o uso da nitroglicerina, nitrito de amila e outros derivados no tratamento da doença coronária: estes compostos são convertidos em óxido nítrico (por um processo não muito bem conhecido) que por sua vez dilata as artérias coronárias (vasos sanguíneos na parede do coração) aumentando assim a sua irrigação. O óxido nítrico também desempenha um papel importante na erecção do pénis, e explica o mecanismo do sildenafil ou Viagra, que envolve o mecanismo referido acima com o guanil ciclico (GMP).

Os macrófagos, células do sistema imunitário, produzem óxido nítrico como composto nocivo para bactérias, devido à sua capacidade de formar espécies reactivas de azoto. Mas em certas circunstâncias isto pode trazer efeitos colaterais indesejáveis: uma sepsis generalizada pode levar a uma produção exagerada de óxido nítrico pelos macrófagos, que leva a uma vasodilatação generalizada podendo ser uma das causas da hipotensão (pressão arterial baixa) na sepsis.

O óxido nítrico tem também funções de neurotransmissor entre as células nervosas. Ao contrário dos outros neurotransmissores que funcionam geralmente no sentido da membrana pré-sináptica para a membrama pós-sináptica, o óxido nítrico (NO), por ser uma gás muito solúvel, pode actuar em todas as células adjacentes paracrinamente e autocrinamente, sem ser preciso estar envolvida uma sinapse física. Esta propriedade pensa-se que poderá estar envolvida na formação da memória.